Искусственный геном из двух генов успешно самовоспроизводится и эволюционирует

Живые клетки обладают свойствами репликаторов — они содержат геномы, состоящие из ДНК, в которых присутствуют гены, необходимые для их же воспроизводства. Неточность репликации создает предпосылку для появления новых вариантов геномов и их адаптивной эволюции, если репликация сопряжена с дарвиновским отбором. Ученые из Японии впервые создали систему с полностью известным и тщательно продуманным химическим составом, воспроизводящую эти базовые свойства жизни. Искусственный «геном» (кольцевая ДНК), выступающий здесь в роли репликатора, включает всего два гена: ген репликазы (взятый от фага phi29) и ген рекомбиназы (Cre). Перед геном репликазы в «геноме» промотор для РНК полимеразы фага T7. Система дополняется комплектом готовых белков и небелковых ингредиентов для обеспечения экспрессии генов. Все реакции протекают в капельках водно-масляной эмульсии — так обеспечивается выполнение условия компартментализации, обязательного для принципиальной возможности адаптивной эволюции молекул-репликаторов. И она действительно наблюдалась в эксперименте: мутации, накопившиеся в кодирующих и некодирующих участках «генома» за 30 «поколений» самовоспроизводства, значительно повысили эффективность репликации.

Создание искусственной системы, воспроизводящую свойства живой клетки, — одна из амбициозных задач на стыке химии и биологии, которые ставит перед собой современная наука. Эта задача представляет интерес в первую очередь в контексте стремления понять процесс возникновения первых живых клеток из неживой материи. Ведь, как говорил Ричард Фейнман «чего не могу воссоздать, того не понимаю». Во вторую очередь важен потенциал практического использования (а как же!) таких искусственных систем в качестве фабрик по эффективной продукции чего-нибудь полезного человечеству.

«Элементы» уже не раз рассказывали о работах, ведущихся в этом направлении, и об их идейном обосновании: см., например, новости Чтобы спастись от паразитов, первым живым системам достаточно было время от времени разделяться на мелкие капли («Элементы», 19.12.2016) и Создано первое живое существо с синтетическим геномом («Элементы», 25.05.2010), а также статьи Синтетическая биология: конструирование живого и Обыгрывая бога. Поэтому мы сразу перейдем к рассказу о новых впечатляющих достижениях.

Обсуждаемая ниже работа была выполнена в лаборатории Токийского университета, которой руководит Норикадзу Итихаси (Norikazu Ichihashi). Лаборатория специализируется именно на создании искусственных систем, способных к самовоспроизводству и эволюции. На странице лаборатории достаточно подробно и четко изложены разноплановые задачи в контексте этой проблематики, над решением которых сотрудники бьются прямо сейчас.

Самая свежая публикация этой группы вышла в ноябрьском номере журнала ACS Synthetic Biology. Авторы сообщают о том, что им впервые удалось получить систему с авторепликацией, в которой роль носителя информации выполняет молекула ДНК, а цикл автовоспроизводства включает в себя репликацию, рекомбинацию, транскрипцию и трансляцию — то есть всю совокупность базовых матричных процессов, лежащих в основе самовоспроизводства живых клеток. Более того, в ходе эксперимента произошла адаптивная эволюция молекулы ДНК и генов, закодированных в этом мини-геноме, увеличившая эффективность репликации в несколько раз.

Заметим, что ранее коллектив этой же лаборатории уже публиковал результаты принципиально схожих экспериментов (N. Ichihashi et al., 2013. Darwinian evolution in a translation-coupled RNA replication system within a cell-like compartment, R. Mizuuchi et al., 2015. Adaptive Evolution of an Artificial RNA Genome to a Reduced Ribosome Environment). Но роль репликатора в тех работах выполнял РНК-геном, в котором присутствовал ген РНК-зависимой РНК-полимеразы фага Qβ (bacteriophage Qbeta), который как раз и обеспечивал репликацию данного генома. Результатом нескольких сотен раундов репликации в сопряжении с трансляцией в компартментализованной системе (компартментами служили капельки воды в масле), привели к многократному повышению эффективности репликации и трансляции благодаря приобретению разнообразных адаптивных мутаций в молекуле РНК.

Следующей целью стало получение автореплицирующейся системы на основе ДНК. Ведь, как ни крути, все известные нам клеточные формы жизни хранят информацию именно в форме ДНК, а не РНК.

Первые успехи были получены к 2015 году (Y. Sakatani et al., 2015. A transcription and translation-coupled DNA replication system using rolling-circle replication). Ученые сконструировали кольцевую ДНК, в которой присутствовал ген, кодирующий полимеразу фага phi29. Их целью было создать систему, в которой бы осуществлялся полный цикл реализации и репликации наследственной информации. То есть с генома должна была считываться копия РНК (это транскрипция), далее на матрице РНК должен был произойти синтез собственно активного белка — полимеразы фага phi29, — которая, в свою очередь, должна была обеспечить размножение генома, содержащего в себе ген этой полимеразы.

Полимераза фага phi29 заметно отличается от большинства других ДНК-полимераз, которые используются обычно в молекулярной биологии (к примеру бактериальная Taq-полимераза). Она гораздо медленнее, но зато для ее работы не требуется циклов смены температур — копирование ДНК происходит при постоянной температуре 30°C. К тому же она способна реплицировать кольцевые ДНК по механизму «катящегося кольца» (rolling circle replication). Чтобы обеспечить автономную репликацию генома с геном полимеразы фага phi29, исследователи создали систему репликации ДНК, сопряженной с транскрипцией и трансляцией (Transcription and Translation coupled DNA Replication, TTcDR). Для этого описанная выше система бесклеточной трансляции была дополнена транскриптазой бактериофага T7. Также в смесь добавили четыре дезоксинуклеотидтрифосфата для синтеза ДНК и короткие цепочки, которые работают в качестве затравок для полимеразы фага phi29. Кроме того, пришлось добавить пирофосфатазу, так как присутствие пирофосфата снижает эффективность работы ДНК-полимеразы. Пришлось потрудиться и над оптимизацией концентрации компонентов системы трансляции, некоторые из которых также подавляли синтез ДНК.

Продуктом работы репликазы фага phi29 является одноцепочечная ДНК, в которой многократно повторена вся последовательность исходной кольцевой матрицы. В свою очередь, на этой одноцепочечной ДНК с помощью все той же полимеразы фага phi29 может начинаться синтез второй, комплементарной, цепочки — уже в противоположном направлении.

Можно заметить, что в описанной системе мы начинаем с кольцевой ДНК, а на выходе получаем линейные молекулы ДНК. Восстановить геном в исходном виде можно, подключив механизм рекомбинации. В публикации 2018 года авторы сообщают о реализации этой идеи (Y. Sakatani et al., 2018. Self-replication of circular DNA by a self-encoded DNA polymerase through rolling-circle replication and recombination). Собственно, в реплицируемый геном была добавлена специальная последовательность — сайт loxP, который узнается рекомбиназой Cre. Саму рекомбиназу Cre добавляли в смесь в виде очищенного белка вместе с системой TTcDR. Поскольку в линейном продукте репликации полимеразой фага phi29 сайт loxP оказывается многократно повторен, рекомбинация, осуществляемая между двумя такими сайтами при участии рекомбиназы Cre, приводит к образованию кольцевых геномов. Они отщепляются от линейной молекулы, которая становится при этом короче.

Первоначально у авторов возникло затруднение: рекомбиназа Cre при добавлении в необходимой для ее работы концентрации очень сильно подавляла работу полимеразы фага phi29. Однако после 53 раундов репликации/рекомбинации в системе с компартментами (в виде водно-масляной эмульсии) эффективность репликации за счет изменений в последовательности реплицируемой ДНК повысилась более чем в 40 раз: закрепились некоторые мутации, изменившие сайт loxP, ген полимеразы фага phi29, а также некоторые участки за пределами этих функциональных областей. Таким образом, эта система оказалась способна не только к репликации, но и к адаптивной эволюции!

Ну что же — все работает. Но что, если сделать еще один шаг в сторону повышения автономности системы: не добавлять рекомбиназу в виде очищенного белка, а включить ген этого фермента в сам реплицируемый геном? Ответ на этот вопрос как раз и стал основой для обсуждаемой статьи.

Эксперимент состоял в проведении генома (в форме кольцевой ДНК) через большое количество раундов репликации с использованием системы TTcDR. Размножаемая ДНК содержит два гена, один из которых кодирует репликазу, а второй — рекомбиназу Cre. Перед геном репликазы фага phi29 размещена последовательность промотора для транскриптазы фага T7, а за геном рекомбиназы Cre — сайт loxP.

Манипуляции со всей этой молекулярной машинерией начинаются с подготовки водного раствора, содержащего ДНК и полный набор компонентов системы TTcDR. 10 мкл этого раствора соединяется с 1 мл масла. Полученная двухфазная система тщательно перемешивается при помощи гомогенизатора, в результате чего образуется водно-масляная эмульсия: в масле взвешены миллионы мельчайших капелек водного раствора (диаметром несколько мкм), каждая из которых представляет собой автономный компартмент. Количество ДНК, добавленной в раствор рассчитано так, чтобы 1 молекула кольцевой ДНК приходилась примерно на 100 капель. Далее смесь помещают в термостат с температурой 30°C на 16 часов. За это время в системе параллельно протекают процессы транскрипции, трансляции (в результате чего синтезируются белки — полимераза и рекомбиназа), репликации и рекомбинации. Это завершает первый раунд репродукции.

Далее следует 5-кратное разведение смеси: 200 мкл эмульсии из первого раунда переносят в новую пробирку, туда же добавляют 800 мкл масла и 8 мкл TTcDR в водном растворе. Выбранная кратность разведения примерно соответствует средней скорости размножения кольцевого генома в этой системе (то есть за 16 часов из одного исходного генома образуется в среднем 4–5 новых посредством репликации/рекомбинации). Затем смесь снова перемешивается в гомогенизаторе. При этом, с одной стороны, водяные капли дробятся, в результате чего геномы разделяются по отдельным компартментам, а с другой стороны, некоторые капли сливаются, обеспечивая приток новой порции компонентов системы TTcDR для дальнейшего осуществления транскрипции, трансляции и репликации.

Всего было проведено 60 таких раундов в двух параллельных экспериментах. В каждом раунде ученые определяли концентрацию ДНК — она довольно сильно изменялась (рис. 2). Иногда даже приходилось прибегать к дорепликации молекул ДНК посредством обычной ПЦР, чтобы эксперимент не закончился слишком быстро. Возможная причина таких провалов в количестве нарабатываемых молекул ДНК может крыться в «перенаселении» системы быстроразмножающимися дефектными ДНК, которые фактически являются паразитическими. Это предположение в рамках данного исследования не проверялось (но сам факт регулярного появления таких паразитических дефектных молекул в подобных системах с саморепликацией был продемонстрирован учеными этой исследовательской группы в других работах, см., например T. Furubayashi et al., 2020. Emergence and diversification of a host-parasite RNA ecosystem through Darwinian evolution).

На 30-м раунде обоих экспериментов ученые отобрали образцы для углубленного анализа: они выделили, клонировали и секвенировали геномы. Целью этих манипуляций было обнаружение признаков эволюции молекул ДНК — логика эксперимента подразумевала, что эволюция должна иметь место. Точность репликации с участием полимеразы фага phi29 не идеальная. Ошибки репликации при ее работе возникают с частотой примерно 6·10−5 на нуклеотид за один раунд. Преимущество при размножении должны получать те геномы, которые накопили «полезные» мутации — то есть те, которые повышают эффективность воспроизводства.

Всего было получено 17 клонированных геномов из первого эксперимента и 18 из второго. Как показало секвенирование, каждый клон содержал множество уникальных мутаций, но некоторые мутации встречались одновременно в двух или более клонах. Именно эти мутации с большей вероятностью являются адаптивными.

Для пяти клонированных геномов из первого эксперимента и для четырех из второго была проведена сравнительная оценка способности к автономной репликации в системе с TTcDR. Анализ провели для тех клонов, которые содержали наибольшее число общих мутаций с другими клонами. Семь из девяти проверенных «эволюционировавших» геномов показали достоверно более высокую эффективность репликации по сравнению с исходным вариантом генома (рис. 3, А). По паре самых активных вариантов из каждого эксперимента (их назвали Evo1, Evo2, Evo 3 и Evo4) использовали в дальнейших функциональных испытаниях, целью которых было выявить конкретные механизмы, обеспечившие повышение эффективности репликации этих версий.



На рис. 3, Б отражены конкретные мутации, присутствующие в этих «выдающихся» версиях генома. Можно видеть, что в области белок-кодирующих генов наблюдались нуклеотидные замены, часть из которых меняла, а часть не меняла аминокислотную последовательность кодируемых белков. В области перед промотором, взятым от фага T7, во всех четырех клонах присутствовали инсерции, которые, в сущности, представляли собой дупликацию некоторого фрагмента этого же промотора. Авторы предположили, что эти дупликации (по крайней мере при прямой их ориентации, как в клонах Evo1, Evo2 и Evo 3) могли повысить эффективность транскрипции, приводя в итоге к образованию большего количества ДНК полимеразы фага phi29 в единицу времени и, как следствие, — к ускорению репликации.

Далее авторы провели несколько серий опытов, в каждой из которых проверялся один из возможных механизмов повышения эффективности репликации четырьмя сверхэффективными репликаторами. Ниже представлены схемы и результаты этих исследований. Каждый из графиков на рис. 4–7 демонстрирует результат трех повторных экспериментов (усредненные значения по трем измерениям).

Первая серия опытов (рис. 4) проверяла влияние мутаций на свойства репликазы фага phi29. В верхней части рисунка показана схема опыта, в нижней — собственно, результаты. Об эффективности полимеразы судили по тому, как много копий ДНК синтезировалось за один 16-часовой раунд репликации. Версия репликазы из генома Evo1 давала такой же результат, что и исходная версия (что логично, ведь в этом гене не появилось каких-либо мутаций, см. рис. 3). У версии из генома Evo2 эффективность оказалась даже ниже, чем у исходной версии белка. А вот версии из геномов Evo3 и Evo4 показали более высокую эффективность, чем исходный белок (хотя только для гена из Evo3 отличие оказалось достоверным).

Вторая серия опытов была нацелена на проверку предположения о том, что благодаря некоторым мутациям молекула ДНК может становиться либо более, либо менее удачным субстратом в качестве матрицы для репликации полимеразой фага phi29 (рис. 5). Ведь свою роль могут играть, к примеру, вторичные структуры, которые потенциально могут возникать внутри ДНК в ходе репликации и тормозить процесс. Достоверно лучшими субстратами в сравнении с исходной версией генома оказались варианты Evo1 и Evo2. Судя по графику, это отличие имеется и для Evo3, хотя оно не достоверно. Особенно заметна разница для Evo1: репликация этого варианта генома шла в 5 раз быстрее, чем исходного.

Третья серия опытов позволила оценить изменения в свойствах рекомбиназы Cre (рис. 6). Резко сниженной оказалась только рекомбиназная активность белка, кодируемого вариантом Evo3, остальные в своей активности не отличались заметно от исходной версии.

Целью четвертой серии экспериментов было оценить влияние мутаций в гене рекомбиназы на способность белка Cre подавлять эффективность репликации посредством phi29 полимеразы (рис. 7). Все 4 версии белка Cre из разных вариантов генома показали менее выраженный подавляющий эффект в отношении репликации матрицы (роль матрицы в этом эксперименте выполняла обычная кольцевая плазмида pUC19, c добавленным loxP сайтом) в сравнении с исходной версией. Но в любом случае репликация шла еще более эффективно, когда в системе вовсе не было рекомбиназы.

К сожалению, до экспериментальной оценки влияния дупликаций в промоторной области геномов дело почему-то не дошло. Здесь авторы предлагают только свои теоретические предположения.

Зато ученые решили проверить еще одну идею в качестве задела на будущее. Потенциально ведь можно пытаться еще наращивать степень автономности данной системы, добавляя в самореплицирующийся геном все больше необходимых генов и исключая соответствующие готовые белковые или РНКовые компоненты смеси TTcDR. Но будет ли система при таком наращивании генома все еще сохранять способность к самовоспроизводству?

Чтобы проверить эту идею, в каждый вариант генома был добавлен фрагмент длиной около 2500 пар оснований, внутри которого присутствовал ген, кодирующий белок bla (этот дополнительный фрагмент встраивали в промежутке между сайтом loxP и промотором фага T7). Исходная версия генома и Evo4 оказались неспособны реплицироваться в таком расширенном виде, между тем как эффективность репликации для клонов Evo1, Evo2, Evo3 после добавления лишнего фрагмента осталась примерно на том же уровне, что и без него.

Конечно же, эта система еще сильно не дотягивает до того, чтобы представлять собой действительно некоторую форму «жизни». Помимо того, что для ее автономной работы не хватает большого количества необходимых белков, которые синтезировались бы внутри системы, здесь нет и намека на способность самостоятельно расти и делиться (формировать новые компартменты), осуществлять полноценный метаболизм (подразумевающий, в частности, активное введение определенных веществ внутрь клеток-компартментов и выведение других во внешнюю среду против градиента концентрации) и саморегуляцию. Но каждое из обозначенных выше свойств живого ученые постепенно учатся воссоздавать в искусственных биохимических системах, — эти работы ведутся многими лабораториями в разных странах. И все более реалистичным представляется, в свете последних достижений, сценарий появления в один прекрасный день новой «жизни из пробирки», эволюционно не связанной с LUCA — общим клеточным предком всех нынешних обитателей Земли.

Источник: Hiroki Okauchi, Norikazu Ichihashi. Continuous Cell-Free Replication and Evolution of Artificial Genomic DNA in a Compartmentalized Gene Expression System // ACS Synthetic Biology. 2021. DOI: 10.1021/acssynbio.1c00430.

Татьяна Романовская

0 0 голоса
Рейтинг статьи

Опубликовано: 10.12.2021 в 01:59

Автор:

Категории: Наука и технологии

Подписаться
Уведомить о
guest
0 комментариев
Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии