Нобелевская премия по химии — 2020

В этом году Нобелевская премия по химии присуждена американке Дженнифер Дудне и француженке Эммануэль Шарпантье «за исследование метода редактирования генома». Они сыграли важнейшую роль в изучении CRISPR — природной системы приобретенного иммунитета у микроорганизмов. С ее помощью микроорганизмы могут находить и избавляться от попавшей в их клетки вирусной РНК или ДНК. Исследуя эту систему, ученым мало-помалу удалось разобраться, из чего она состоит и как работает. А Дудна и Шарпантье довели это понимание до такой четкости, что смогли создать ее искусственный аналог, работающий точно и эффективно там, где необходимо самому исследователю в зависимости от поставленных задач.

Если научное изобретение становится детской игрушкой, то это означает его народное признание. А если за изобретение дается Нобелевская премия, то оно, безусловно, получило признание всего научного мира. Именно это и произошло с открытием и последующим всесторонним исследованием технологии редактирования генома, основанной на CRISPR — коротких палиндромных повторах, регулярно расположенных кластерами (clustered regularly interspaced short palindromic repeats).

Хотя с тех пор, как были проведены важнейшие исследования в этой области, не прошло и 15 лет, уже можно купить для своего ребенка набор «сделай сам», позволяющий создать с помощью CRISPR светящиеся дрожжи. Капаешь в дрожжи чуть-чуть мутного раствора с CRISPR-плазмидами, и — о чудо! — простые пекарские дрожжи начинают светиться зеленым. В инструкции вполне доступным для детей языком объясняется, как в ДНК дрожжей вставляется ген светящегося белка. Последовательность светящегося белка (или какая-нибудь другая — на выбор исследователя или природы) заключается между определенными повторами, к ним прикрепляется кусочек РНК (trans-CRISPR-РНК или сокращенно tracrРНК, см. Trans-activating crRNA). Он необходим, чтобы комплементарно соединиться с повтором, — тогда на него сможет сесть белок Cas9 и разрезать ДНК в нужном месте. Затем на место разреза с помощью ферментов вшивается светящийся белок. Главное здесь — система «crРНК + tracrРНК + Cas9».



«Элементы» уже много раз обращались к теме CRISPR, отслеживая ход, а лучше сказать, стремительный бег исследований, стартовавший с открытием CRISPR. В частности, в новости Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR («Элементы», 13.07.2017) читатель может еще раз просмотреть, как в 1980-х годах от первых открытий странных повторов в геномах архей ученые постепенно пришли к пониманию фантастической системы наследуемого иммунитета бактерий («квазиламарковский механизм» по выражению Евгения Кунина), затем — к расшифровке молекулярной машины этого иммунитета и, в конце концов, к пониманию того, как это все можно использовать в биомедицинских, пищевых и химических отраслях. Я в одной фразе уместила целую эпоху бешеной эстафетной гонки коллективов ученых по всему миру. Не так просто понять, какие ученые в этой многолюдной эстафете были самыми быстрыми и прозорливыми бегунами, но Нобелевский комитет решил за нас эту задачу, признав ими американку Дженнифер Дудна (Jennifer Anne Doudna) и француженку Эммануэль Шарпантье (Emmanuelle Marie Charpentier).

Здесь я не буду повторять механизмы работы CRISPR-систем, а лишь обрисую тот участок эстафеты, на котором бежали две нынешние Нобелевские героини. В анонсе Нобелевского комитета сказано, что Дудна и Шарпантье отмечены за открытие «одного из лучших инструментов генной инженерии: генетических ножниц CRISPR-Cas9, используя которые, ученые могут редактировать ДНК животных, растений и микроорганизмов с очень высокой точностью» («Emmanuelle Charpentier and Jennifer A. Doudna have discovered one of gene technology’s sharpest tools: the CRISPR/Cas9 genetic scissors. Using these, researchers can change the DNA of animals, plants and microorganisms with extremely high precision.»).

Дудна и Шарпантье открыли тончайшие грани этих ножниц и отладили их. Работая с бактерией Streptococcus pyogenes, они разбирали, как работает белок Cas9 (M. Jinek et al., 2012. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity). Что необходимо для того, чтобы он разрезал двойную нить ДНК в нужном месте? Сама по себе crРНК, как было показано в опытах, не может посадить белок Cas9 в нужное место и заставить его работать. А вот если к раствору добавить комплементарный кусочек повтора tracrРНК, то Cas9 вступает в игру — садится на двойную ДНК (в замкнутой плазмиде или линейной ДНК-последовательности) и разрезает ее. В тех же экспериментах было показано, что если спейсер не будет комплементарен своему целевому участку, то система тоже не сработает. Еще раньше было показано, что tracrРНК, заставляет фермент РНКазу III нарезать исходную длинную цепочку РНК из повторов и спейсеров на отдельные фрагменты «повтор + спейсер», без tracrРНК данный фермент не работает. Но теперь выяснилось, что без tracrРНК фермент Cas9 тоже не работает. Таким образом, кусочек tracrРНК выполняет две важные функции в работе системы CRISPR.

Затем, опять же экспериментально, был решен вопрос, что именно делает tracrРНК. Рассматривались две возможности: либо tracrРНК ставит crРНК в правильное положение, после чего фермент может начать нарезку, либо он активирует сам фермент. Оказалось, что верна первая версия. Дотошно и тщательно Дудна и Шарпантье выясняли минимально необходимую рабочую длину кусочков tracrРНК и crРНК, а также где, как и какие нити будут разрезаться, где именно происходит разрез, сколько нуклеотидов надо отступить от целевой последовательности и многие другие важные детали работы этой системы.

Сотни экспериментов потребовались для того, чтобы создать рабочую лошадку биоинженера — точные ножницы для вырезания и вшивания требуемых фрагментов ДНК или даже единичных нуклеотидов. Эта рабочая лошадка представляет собой «химерную» РНК, соединяющую в себе и crРНК, и tracrРНК. Вместо последней — петля с комплементарной последовательностью, создающая эффект сдвоенной РНК. Дудна и Шарпантье проверили, как работает эта «химера» — сможет ли она из плазмиды вырезать последовательность зеленого светящегося белка. Идея этого эксперимента была простой: если сможет и раствор станет светлым, то значит, химера сработала, а если раствор останется зеленым, то ничего не получилось. Но у них все получилось — не зря педантично и вдумчиво проверялся каждый шаг этого исследования. Да и само оно было лишь отдельным эпизодом длинной истории размышлений и работы Дудны и Шарпантье.

И самим авторам работы, и всем их коллегам и критикам было ясно, что у этого изобретения большое будущее: система CRISPR-Cas9 позволяет вырезать из последовательности ДНК любую часть, а также вставить в нее любой фрагмент. Но масштабы практического применения этого инструмента невозможно предугадать и сейчас, спустя годы после его открытия. Хотя, по мнению новоиспеченных лауреатов, до использования молекулярных ножниц для лечения человеческих генетических недугов потребуется еще очень много работы. Ведь точность относительна, а ошибка в один нуклеотид может оказаться не менее опасной, чем сама болезнь.

А пока ученые с успехом испытывают новую систему генетического редактирования на животных, растениях и микроорганизмах. Вы знали, что китайские генетики с помощью CRISPR-редактирования создали свинок, которые не накапливают жир (Q. Zheng et al., 2017. Reconstitution of UCP1 using CRISPR/Cas9 in the white adipose tissue of pigs decreases fat deposition and improves thermogenic capacity)? В перспективе возможно создание низкоаллергенных сортов культурных растений, безглютеновой пшеницы, тест-полосок на разные мутантные варианты микроорганизмов и т. д. Проектов множество, но в их основе — использование созданного Дудной и Шарпантье инструмента для генетического редактирования.

Елена Наймарк

Опубликовано: 12.10.2020 в 11:13

Автор:

Категории: Наука и технологии

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о